Следствие было поручено вести вновь назначенному генеральному прокурору Руденко.
На первом же допросе 8 июля Берия был обвинен в антисоветской заговорщицкой деятельности, своей вины он не признал. Опытные следователи, как считает юрист Андрей Сухомлинов, автор книги о деле Берии, понимали, что главным обвинением будет не мифическая антисоветская деятельность, а конкретные должностные преступления, и поэтому старались доказать как можно больше фактов, характеризующих таковые.

Важным фактом в деле Берии явилось существование токсикологической лаборатории профессора Майрановского, где яды испытывались на людях (сам Майрановский был арестован ещё в 1951 по делу ЕАК).

Много внимания следователи уделили периоду деятельности Берии на руководящих постах в Грузии и Закавказье. В вину Берии поставили репрессии, проводившиеся там в 1937 году, организацию которых приписали Берии.

Также Берии и его окружению инкриминировалось убийство полпреда СССР в Китае И. Т. Бовкун-Луганца с женой в 1939 году, расстрел без суда и следствия в 1940 году жены маршала Г. И. Кулика — Симонич-Кулик К. И., расстрел группы из 25 человек заключённых в 1941 году в Куйбышеве, Саратове и Тамбове.

Вопреки слухам о массовых изнасилованиях Берии, в деле содержится только одно заявление об изнасиловании, которое Берия якобы осуществил в 1949 году. Заявление поступило от постоянной любовницы Берии Дроздовой, от которой у него был внебрачный ребёнок. По-видимому, это заявление было написано под давлением следствия.